一．服務內容
我公司提(ti)供的(de)單細(xi)胞(bao)(bao)建(jian)庫測(ce)(ce)序(xu)技(ji)術(shu)服(fu)務是(shi)針(zhen)對(dui)大規模細(xi)胞(bao)(bao)群體(ti)進(jin)行表(biao)達譜分析，具(ju)體(ti)服(fu)務內容是(shi)利(li)用10x Genomics微流(liu)控凝膠微珠(zhu)技(ji)術(shu)對(dui)細(xi)胞(bao)(bao)懸(xuan)液樣本中的(de)500~10,000個(ge)單細(xi)胞(bao)(bao)進(jin)行捕(bu)獲(huo)標(biao)(biao)記(ji)，同時(shi)對(dui)每(mei)個(ge)標(biao)(biao)記(ji)了的(de)細(xi)胞(bao)(bao)中的(de)RNA分子進(jin)行獨立標(biao)(biao)記(ji)，建(jian)成用于illumina測(ce)(ce)序(xu)平臺的(de)轉錄組測(ce)(ce)序(xu)文庫。建(jian)成的(de)文庫將(jiang)在illumina NGS測(ce)(ce)序(xu)平臺上(shang)進(jin)行測(ce)(ce)序(xu)。最終利(li)用10x Genomics的(de)Cell Ranger對(dui)測(ce)(ce)序(xu)的(de)結(jie)果進(jin)行解碼，并(bing)針(zhen)對(dui)單個(ge)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)表(biao)達譜差異對(dui)樣本細(xi)胞(bao)(bao)群進(jin)行細(xi)胞(bao)(bao)亞群分析。
二(er)．實(shi)驗操作步驟概(gai)述
1. 對單細胞懸浮(fu)液(ye)樣本進行(xing)10x Genomics上(shang)機，制備油(you)包(bao)水微(wei)滴乳濁液(ye)（GEMS）。
2. 油(you)包水(shui)微滴乳濁液上(shang)PCR儀，進行逆轉錄操作。
3. 破乳后進行cDNA的(de)回(hui)收、純化和擴增(zeng)等(deng)操作(zuo)。
4. 進行(xing)片段(duan)化，末端修復(fu)，加A、加接頭，Sample Index PCR等后續(xu)文(wen)庫構建操作。
三．實驗結果
我(wo)公司完成10x Genomics建庫(ku)(ku)技術(shu)服務的過程中提供2個結果，分別是文庫(ku)(ku)質(zhi)檢結果報(bao)告和測序結果分析報(bao)告。
四．樣品要求及注意事項
1. 接收的(de)樣(yang)(yang)品(pin)為單細胞懸液，如需組織(zhi)解離，細胞分(fen)選等樣(yang)(yang)品(pin)制備需由客戶自行(xing)完成(cheng)。
2. 單細(xi)胞(bao)懸液中(zhong)，細(xi)胞(bao)間無粘連，無大于(yu)40uM的(de)細(xi)胞(bao)碎片或其(qi)他(ta)顆粒物），單細(xi)胞(bao)懸液上(shang)樣前需過(guo)40uM細(xi)胞(bao)濾(lv)網（如Falcon cell strainer, REF 352340），確保不會堵塞微流控通道。
3. 細(xi)胞懸液中單細(xi)胞個(ge)(ge)數應大于(yu)預期實測(ce)(ce)細(xi)胞個(ge)(ge)數的2倍，如預期測(ce)(ce)到500個(ge)(ge)單細(xi)胞的數據，應提供(gong)至(zhi)少1000個(ge)(ge)單細(xi)胞。
4. 細(xi)胞成活率應大(da)于85%（用臺盼藍染(ran)色檢測）。
5. 上機單細(xi)胞懸(xuan)液(ye)體積應小于(yu)30ul，建議細(xi)胞懸(xuan)液(ye)濃度(du)大約為1000個細(xi)胞/ul。
6. 如一(yi)次性上(shang)機(ji)多個樣(yang)品，第一(yi)個樣(yang)品制(zhi)備完成到最后一(yi)個樣(yang)品制(zhi)備完成時間相差不超過(guo)1個小時。
五．服務驗(yan)收標(biao)準
在細(xi)胞(bao)樣(yang)品達(da)到(dao)上述(shu)要(yao)求的前提下，結果達(da)到(dao)如(ru)下標準：
1.測序(xu)文庫合格(ge)：文庫檢測為單峰，且(qie)濃度高于3nM，體積(ji)大于25ul。
2.細胞捕獲(huo)效率達到50%：最(zui)終測序數(shu)據(ju)結果中(zhong)的細胞數(shu)達到50%的起始(shi)細胞數(shu)。
六．服(fu)務承諾(nuo)
1. 對于達到樣(yang)(yang)本(ben)要(yao)求(qiu)的(de)實驗(yan)(yan)，由于細(xi)胞計數(shu)誤差(cha)等(deng)實驗(yan)(yan)中存在的(de)不確定(ding)性(xing)，實驗(yan)(yan)結(jie)果(guo)在上述標(biao)(biao)準(zhun)的(de)±20%以內都(dou)為可以接受(shou)的(de)范圍。如(ru)果(guo)結(jie)果(guo)在驗(yan)(yan)收標(biao)(biao)準(zhun)20%以下(xia)的(de)（即(ji)捕獲效率低(di)于40%）可判定(ding)實驗(yan)(yan)失敗，公司(si)將承擔該樣(yang)(yang)本(ben)的(de)試(shi)劑耗材及服(fu)務費等(deng)全部費用(yong)。
2. 如果實驗過程中確認試劑耗材(cai)質量(liang)的(de)問題，我公司負責向10x Genomics廠家申(shen)請賠付。（通(tong)過其它渠道(dao)采購的(de)試劑耗材(cai)，我們(men)也(ye)將(jiang)協助(zhu)客戶完成索賠）
3. ;如(ru)果細胞樣品未達到要求(qiu)，客戶可以選擇重(zhong)新(xin)送樣或風險上機(ji)，風險上機(ji)將不能按照上述標(biao)準驗(yan)收(shou)。
七．常見問題解答
1. 10x Genomics廠家的捕(bu)獲(huo)成功標準是65%，為(wei)什么貴公(gong)司承諾只(zhi)有50%？
答：廠家測試捕獲(huo)效(xiao)率用的(de)是細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)系，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)系樣品(pin)很容易制備(bei)成(cheng)單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)懸(xuan)液，且能保證較(jiao)高的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)活(huo)性(xing)和完整性(xing)，而服務項目客(ke)戶很少用細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)系，大部(bu)分是用組織解離(li)制備(bei)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)懸(xuan)液，其細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)成(cheng)活(huo)率相對(dui)較(jiao)低，而且細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)計數的(de)方(fang)法也會給結果造成(cheng)一定偏差，因(yin)此我們把標準定在50%。
2. 建(jian)好的文(wen)庫(ku)送給測序(xu)公司(si)(si)上機前(qian)，文(wen)庫(ku)質檢達不到測序(xu)公司(si)(si)的合格標準怎么辦(ban)？
答：測序(xu)公司(si)出于免(mian)責的考慮(lv)，對(dui)客(ke)戶自建的文庫(ku)(ku)質(zhi)檢(jian)(jian)(jian)(jian)標準(zhun)會(hui)比較嚴格(ge)，因此有可能我們庫(ku)(ku)檢(jian)(jian)(jian)(jian)沒問題的樣品測序(xu)公司(si)會(hui)判(pan)(pan)定為(wei)不合格(ge)。請(qing)把測序(xu)公司(si)的文庫(ku)(ku)質(zhi)檢(jian)(jian)(jian)(jian)結(jie)果(guo)發(fa)送劉(liu)元和牛松，我們根據質(zhi)檢(jian)(jian)(jian)(jian)結(jie)果(guo)判(pan)(pan)定是否應承擔測序(xu)上機風(feng)險(xian)。
3. 如(ru)果(guo)實驗失(shi)敗了，貴公司如(ru)何賠償？
答(da)：兩種情況，一是(shi)如果因10x芯片或試劑導致(zhi)實驗(yan)失敗(bai)，我(wo)(wo)們負(fu)責(ze)聯系廠家索(suo)賠，服(fu)務項(xiang)目就更換試劑耗材(cai)重新做實驗(yan)。二是(shi)客(ke)戶細胞(bao)樣(yang)品合格、非風險(xian)上機情況下建(jian)庫失敗(bai)，就不收(shou)取(qu)費用。實驗(yan)過程中的(de)問題，我(wo)(wo)們和客(ke)戶應本著互信原則(ze)協商解決，實驗(yan)失敗(bai)我(wo)(wo)們不對客(ke)戶細胞(bao)樣(yang)品進行賠償。
4. 除(chu)了利用10x Genomics的Cell Ranger進(jin)行的標準分析外，貴(gui)公(gong)司還能(neng)提供哪些分析？
答： 基本分析
⑴ 提取測序序列 將bcl文件轉化為fastq，生成后(hou)期的樣(yang)本(ben)index序列文件，UMI序列及MRNA序列。
⑵ 序列比對注釋(shi) 將序列比對到相應的參考(kao)基因(yin)組(zu)的基因(yin)區域。
⑶ 按(an)照(zhao)細胞和基(ji)因組信息統(tong)計(ji)UMI，barcode信息，計(ji)算細胞和基(ji)因表達矩陣(zhen)。
其他高級(ji)分析
⑴ t-SNE降(jiang)維分析(xi)及聚類：利(li)用(yong)(yong)T分布隨(sui)機相鄰(lin)嵌入(ru)法(t-SNE)對(dui)數(shu)據降(jiang)維處理(li)，基于2維數(shu)據展示。利(li)用(yong)(yong)聚類算法對(dui)細胞進行(xing)聚類分析(xi)，聚類后的細胞群體之間進行(xing)差異表達分析(xi)。
⑵ 基(ji)因的(de)富集分析：差(cha)異基(ji)因進行后期的(de)基(ji)因功能分析(GO和Pathway)。
