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文獻與應用 | BEX品牌CUY21 EDIT II在免疫方面的應用
來源：      時間：2023-07-18

01
.產品介紹
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CUY21為全球的轉(zhuan)基因研究開創了諸多(duo)全新方向。最新款CUY21EDITII采用先進的脈(mo)沖(chong)芯(xin)片控制技術(shu)，BEX的多(duo)步脈(mo)沖(chong)、反向脈(mo)沖(chong)及恒流脈(mo)沖(chong)轉(zhuan)化模式(shi)，無需(xu)任何專用試劑，提供高效(xiao)高存活率的轉(zhuan)化。


02
.主要應用

  • 細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的高(gao)效(xiao)轉染(ran)，尤其適合于(yu)原代細(xi)(xi)(xi)胞(bao)、免療(liao)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)、干細(xi)(xi)(xi)胞(bao)等難轉染(ran)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的高(gao)效(xiao)高(gao)存活率(lv)轉化

  • 在(zai)體/離體受精卵CRISPR/Cas9高效基因編輯

  • 體內基因轉染(in-utero，in-vivo，in-ovo)

  • 體外(wai)基因(yin)轉染(ex-ovo，ex-vivo)

  • 貼壁細胞基因轉染


03
.專業突出性能

1.先進組合脈沖技術，針對不同樣品皆可提供完美的轉化效果，真正一機多能。

1.1 Decay(V)+Square(V)組合模式：

高壓(ya)瞬時穿孔(kong)脈(mo)(mo)沖(chong)(chong)+低壓(ya)導入(ru)脈(mo)(mo)沖(chong)(chong)(動(dong)態衰減(jian)/靜態衰減(jian))+反轉脈(mo)(mo)沖(chong)(chong)。主要用于懸(xuan)浮和貼壁細(xi)胞的基因(yin)轉染。

1.2 Square(V)方波(bo)電(dian)壓模式：

釋(shi)放方波(bo)脈(mo)沖，主要用于活體轉基因。 

1.3 Sauare(mA)恒(heng)流方波(bo)模式：

恒流(liu)脈沖是突破性的脈沖技術，可滿足(zu)極其脆(cui)弱組織或細胞的高效基因轉染。

小鼠(shu)在體受精卵CRISPR/CAS9基因(yin)編輯是目前全新(xin)的(de)研究(jiu)方向，利用恒流轉化模(mo)式可(ke)以(yi)獲(huo)得高(gao)生存率(lv)和高(gao)轉化效(xiao)率(lv)的(de)實驗(yan)結果(guo)。

2.無需任何額外的轉染試劑

BEX公司研發了日本乃至全球精密可靠的脈沖技術，包括組合脈沖，反轉脈沖，衰減脈沖，恒流脈沖等，可以無需任何專用轉染試劑，即可實現高效轉染。這些技術也被其他公司部分采用。

3.大屏幕直觀設定轉化參數，并實時監測顯示實際實驗數據

5.7寸大屏幕顯示設定參數，實時電壓，電流檢測值，脈沖波形，讓整個轉化過程一目了然，并保證了實驗的可重復性。

04
.應用方向—免疫方面
1.受精卵基因編輯
2015年，日本千葉大(da)學的(de)Masakazu Hashimoto以及(ji)德島大(da)學的(de)Tatsuya Takemoto，使用(yong)日本BEX公司(si)CUY21EDIT II多模式電轉(zhuan)化儀(yi)，首(shou)次發明(ming)了(le)以CRISPR/Cas9技術為基礎的小鼠受精卵/胚胎離體基因編輯，相關研(yan)究(jiu)成果發表于Developmental Biology等期刊。成為建立基(ji)因編輯小鼠(shu)模(mo)型(xing)的研(yan)究(jiu)者爭(zheng)相效仿的黃(huang)金(jin)方(fang)法。

CUY21EDIT II獨有的恒流轉(zhuan)化模(mo)式，發明了(le)受精(jing)卵在體輸卵管轉(zhuan)化(i-GONAD法)。這一方法的出(chu)現，較(jiao)之上面(mian)的離體受精(jing)卵基因編輯方法又(you)有了(le)突破性進展(zhan)。

應用案例

為了鑒定參與外(wai)胚層譜系形成的BET蛋(dan)白(bai)，我們分析了缺(que)乏Brd4、Brd2和雙(shuang)突變體的突變胚胎。只有在Brd4/Brd2雙缺陷(xian)桑椹胚中，NANOG陽性外胚層細胞(bao)的消失才明(ming)顯。因此，JQ1處理的胚胎(tai)的表型不是通過Brd4-或Brd2單缺陷而復制的，而是僅(jin)通過Brd4/Brd2雙(shuang)缺陷復制的，證明(ming)了Brd2和(he)Brd4在外胚層譜系的重要作用[1]。

為了獲(huo)得基因敲除胚胎(tai)，使用(yong)CUY21 EDITII、GE-101鉑板電(dian)極（長10 mm，寬3 mm，高0.5 mm，間隙1 mm）和GE-1電(dian)極夾（日本東京(jing)BEX有(you)限公司）對Brd2tg/tg卵(luan)母細胞進行電穿孔(kong)得到。

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圖1 CRISPR-Cas9系統通過CUY21EDIT II電轉儀生成Brd2+/+；Brd4-、Brd2tg/+；
Brd4-和Brd2tg/tg；Brd4-基因(yin)敲除胚胎的策略示意圖(tu)。


2.外泌體載藥
外泌(mi)體，活細(xi)胞釋放到(dao)細(xi)胞外微環(huan)境的磷脂雙分子囊泡，其(qi)直徑大小(xiao)約為30~150nm。因天然(ran)外泌(mi)體內部(bu)富含脂質(zhi)、蛋白質(zhi)和核酸等物質(zhi)的特(te)性(xing)，近年(nian)來(lai)外泌(mi)體作為藥物遞送載體受到(dao)了(le)越來(lai)越多研究者們的關注。

CUY21EDITII電轉儀(yi)通過(guo)(guo)對(dui)外(wai)泌(mi)(mi)體囊泡施(shi)加(jia)適當(dang)的電流擊穿形(xing)成囊泡微(wei)(wei)孔，藥物(wu)通過(guo)(guo)形(xing)成微(wei)(wei)孔加(jia)載(zai)到外(wai)泌(mi)(mi)體中，外(wai)泌(mi)(mi)體膜(mo)隨后會很快恢復完(wan)成封裝。CUY21EDIT II獨特的動態衰減脈沖技術及恒流電阻測定技術使轉染過程中電流輸出更穩定，從而高效封裝藥物載入外泌體中。

應用案例

MicroRNA（miRNA）是關鍵(jian)生物過(guo)程中(zhong)基因(yin)(yin)表(biao)達的重要調節因(yin)(yin)子，是糖尿(niao)病傷口治療領域的一種有前(qian)景的核酸藥物。在Chengqi Yan等人的研究中(zhong)使用牛奶(nai)來(lai)源的外(wai)泌體作為miR-31-5p遞送的新系統，并通過(guo)CUY21EDIT II (BEX, Japan) 電轉儀電穿孔成功地將miR-315P模擬物封裝到牛奶外泌體內。該研究證明了加載在(zai)外(wai)(wai)泌(mi)體(ti)中(zhong)的miR-31-5p實(shi)現了更高的細胞攝取并能(neng)夠抵抗降(jiang)解并且(qie)miRNA-外(wai)(wai)泌(mi)體(ti)在(zai)體(ti)外(wai)(wai)顯著(zhu)改善了內(nei)皮細胞功(gong)能(neng)，同時在(zai)體(ti)內(nei)促進血管生成和(he)增強糖尿病傷口(kou)愈合[2]。

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3. 核酸疫苗
核(he)(he)酸疫(yi)苗（nucleic acid vaccine），也稱基因疫(yi)苗（genetic vaccine），是指將含有編碼(ma)的(de)蛋(dan)白基因序列的(de)質粒載(zai)體，經肌(ji)肉注射(she)等方法導入宿(su)主(zhu)體內，通(tong)過宿(su)主(zhu)細胞(bao)表達抗原蛋(dan)白，誘導宿(su)主(zhu)細胞(bao)產生(sheng)(sheng)對該抗原蛋(dan)白的(de)免(mian)疫(yi)應答，以達到預防和(he)治療(liao)疾病的(de)目(mu)的(de)。核(he)(he)酸疫(yi)苗是利用現(xian)代(dai)生(sheng)(sheng)物技(ji)術免(mian)疫(yi)學(xue)、生(sheng)(sheng)物化學(xue)、分(fen)子生(sheng)(sheng)物學(xue)等研(yan)制成的(de)，分(fen)為DNA疫(yi)苗和(he)RNA疫(yi)苗兩種(zhong)。

應用案例

盡管存在有效的(de)抗病(bing)(bing)毒治(zhi)療，但沒(mei)有治(zhi)愈或預防(fang)性(xing)(xing)疫(yi)苗(miao)，HIV-1仍然是世界范圍內的(de)一個主(zhu)要公共(gong)衛生問題。病(bing)(bing)毒感染與宿主(zhu)特異性(xing)(xing)免疫(yi)的(de)許多(duo)逃逸機制有關，而且(qie)保護的(de)相(xiang)關性(xing)(xing)仍然不完(wan)全清楚。受減(jian)毒活病(bing)(bing)毒療效的(de)啟發，Leroy等人已經開(kai)發了一種創(chuang)新(xin)的(de)DNA 疫(yi)苗(miao) CAL-SHIV-IN-IRES IL-7和 CAL-SHIV-IN-IRES IL-15。

我(wo)們將兩種DNA 疫苗 CAL-SHIV-IN-IRES IL-7和(he) CAL-SHIV-IN-IRES IL-15通過皮內注射＋電(dian)穿孔(kong)（使用CUY21EDIT II (BEX, Japan) 電轉儀和 10 mm 直徑的LF567電極進行電穿孔）以及肌肉注射(she) (IM)聯合免疫BALB/cJ 小鼠和恒河猴，檢測兩(liang)種共同(tong)注(zhu)射(she)的DNA 疫苗在小鼠和恒河猴體(ti)內(nei)的免疫原性，并將免疫應答與親本疫苗 CAL-SHIV-IN-產(chan)生(sheng)的(de)免(mian)疫(yi)(yi)應(ying)答進行了比(bi)較。這種聯合免(mian)疫(yi)(yi)在小鼠和(he)(he)恒(heng)河猴體內都引發了有效的(de)疫(yi)(yi)苗特異性(xing) CD4和(he)(he) CD8T 細胞。免(mian)疫(yi)(yi)后40周，恒(heng)河猴的(de)血漿(jiang)和(he)(he)粘膜隔(ge)室均檢測到 ADCC作用(ADCC)抗體，并被細胞因子增(zeng)強[3]。

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圖(tu)2  BALB/cJ 小鼠(shu)(shu)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)：第(di)一組 20 只小鼠(shu)(shu)用 CALSHIV-IN- 疫(yi)(yi)(yi)苗免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)；第(di)二(er)組20只小鼠(shu)(shu)用 CAL-SHIV-IN-IRES IL-7 和(he) CAL-SHIV-IN-IRES IL-15 通(tong)過皮內注(zhu)射+電穿孔 (ID/EP) 和(he)肌肉注(zhu)射 (IM) 聯合(he)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)。6周后給予同源疫(yi)(yi)(yi)苗加強劑。在免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)后第(di) 2、4、8 和(he) 10 周，采集脾臟(zang)以監測(ce)和(he)評估細(xi)胞反應和(he)血液樣本，以檢測(ce)血清中的 HIV 特異性(xing)抗(kang)體。
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圖3 獼(mi)猴(hou)的免疫接(jie)種和(he)(he)取(qu)樣。第一組3只獼(mi)猴(hou)用 CALSHIV-IN- 疫苗(miao)免疫；第二(er)組3只獼(mi)猴(hou)用 CAL-SHIV-IN-IRES IL-7 和(he)(he) CAL-SHIV-IN-IRES IL-15 通過皮內(nei)注(zhu)射+電穿孔 (ID/EP) 和(he)(he)肌(ji)肉注(zhu)射 (IM) 聯合免疫。16周(zhou)后進行了同源疫苗(miao)的強(qiang)化(hua)。采集不同的樣本(ben)來監(jian)測和(he)(he)評(ping)估40周(zhou)內(nei)的免疫反(fan)應。

參考文獻：

[1] Tsume-Kajioka M, Kimura-Yoshida C, Mochida K, Ueda Y, Matsuo I. BET proteins are essential for the specification and maintenance of the epiblast lineage in mouse preimplantation embryos[J]. BMC Biol, 2022,20(1):64-70.

[2] Yan C, Chen J, Wang C, et al. Milk exosomes-mediated miR-31-5p delivery accelerates diabetic wound healing through promoting angiogenesis[J]. Drug Deliv, 2022,29(1):214-228.

[3] Leroy LA, Mac Donald A, Kandlur A, Bose D, Xiao P, Gagnon J, Villinger F, Chebloune Y. Cytokine Adjuvants IL-7 and IL-15 Improve Humoral Responses of a SHIV LentiDNA Vaccine in Animal Models[J]. Vaccines (Basel), 2022, 10(3):461-483.