一．服務內容
我(wo)公司提(ti)供的(de)(de)(de)單(dan)(dan)細(xi)胞(bao)建庫(ku)測(ce)序(xu)技術服(fu)務是針(zhen)對(dui)(dui)大規模(mo)細(xi)胞(bao)群(qun)體進行(xing)表達譜分析，具體服(fu)務內容是利用(yong)10x Genomics微流(liu)控凝膠微珠技術對(dui)(dui)細(xi)胞(bao)懸液樣本(ben)中(zhong)的(de)(de)(de)500~10,000個單(dan)(dan)細(xi)胞(bao)進行(xing)捕獲(huo)標記(ji)，同時對(dui)(dui)每個標記(ji)了的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)中(zhong)的(de)(de)(de)RNA分子進行(xing)獨立標記(ji)，建成用(yong)于illumina測(ce)序(xu)平(ping)臺的(de)(de)(de)轉錄組測(ce)序(xu)文(wen)庫(ku)。建成的(de)(de)(de)文(wen)庫(ku)將在(zai)illumina NGS測(ce)序(xu)平(ping)臺上進行(xing)測(ce)序(xu)。最終利用(yong)10x Genomics的(de)(de)(de)Cell Ranger對(dui)(dui)測(ce)序(xu)的(de)(de)(de)結果(guo)進行(xing)解碼，并(bing)針(zhen)對(dui)(dui)單(dan)(dan)個細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)表達譜差異對(dui)(dui)樣本(ben)細(xi)胞(bao)群(qun)進行(xing)細(xi)胞(bao)亞群(qun)分析。
二．實驗操作步驟(zou)概(gai)述
1. 對(dui)單細胞懸(xuan)浮(fu)液(ye)樣本(ben)進行10x Genomics上(shang)機(ji)，制備油包水微(wei)滴(di)乳濁液(ye)（GEMS）。
2. 油包水微滴乳濁(zhuo)液上(shang)PCR儀，進行(xing)逆轉錄操作。
3. 破乳后進行cDNA的回(hui)收、純化和(he)擴增等操作。
4. 進行片段化，末端修復，加(jia)A、加(jia)接(jie)頭，Sample Index PCR等后(hou)續文庫構建(jian)操(cao)作。
三．實驗結果
我(wo)公司(si)完(wan)成(cheng)10x Genomics建庫技術(shu)服務的過程中提(ti)供2個(ge)結果(guo)，分(fen)別是(shi)文庫質檢(jian)結果(guo)報(bao)告(gao)和測序結果(guo)分(fen)析(xi)報(bao)告(gao)。
四．樣品(pin)要求及注意事(shi)項
1. 接收的樣品(pin)為單細(xi)胞懸液(ye)，如需(xu)組織解離(li)，細(xi)胞分選等樣品(pin)制(zhi)備需(xu)由客(ke)戶自行(xing)完成。
2. 單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)懸(xuan)液中，細(xi)胞(bao)(bao)(bao)間(jian)無粘連，無大于40uM的細(xi)胞(bao)(bao)(bao)碎片或其(qi)他顆粒物），單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)懸(xuan)液上樣前需過40uM細(xi)胞(bao)(bao)(bao)濾(lv)網（如Falcon cell strainer, REF 352340），確(que)保不會堵塞微流控通道(dao)。
3. 細(xi)胞(bao)懸液中單細(xi)胞(bao)個數應(ying)大(da)于預期實測(ce)(ce)細(xi)胞(bao)個數的2倍，如預期測(ce)(ce)到500個單細(xi)胞(bao)的數據(ju)，應(ying)提供至少1000個單細(xi)胞(bao)。
4. 細胞(bao)成活率應大(da)于85%（用臺盼藍染色檢(jian)測）。
5. 上機(ji)單細(xi)(xi)胞(bao)懸液體積應小于30ul，建議細(xi)(xi)胞(bao)懸液濃(nong)度大約為1000個細(xi)(xi)胞(bao)/ul。
6. 如一次性上機多個(ge)(ge)樣(yang)品(pin)，第(di)一個(ge)(ge)樣(yang)品(pin)制備(bei)完成到最后(hou)一個(ge)(ge)樣(yang)品(pin)制備(bei)完成時間(jian)相差(cha)不(bu)超過1個(ge)(ge)小時。
五．服務驗(yan)收標準
在(zai)細胞樣品(pin)達到(dao)上述(shu)要求的前提下，結果達到(dao)如下標(biao)準：
1.測序文庫(ku)合格：文庫(ku)檢(jian)測為單峰，且濃(nong)度高于3nM，體(ti)積大于25ul。
2.細(xi)胞(bao)捕獲(huo)效率達到(dao)50%：最終測序數(shu)據結果中的(de)細(xi)胞(bao)數(shu)達到(dao)50%的(de)起始細(xi)胞(bao)數(shu)。
六．服(fu)務承(cheng)諾
1. 對(dui)于達到樣(yang)本(ben)(ben)要(yao)求的(de)實(shi)驗(yan)(yan)，由于細胞計數誤差等實(shi)驗(yan)(yan)中存在(zai)的(de)不確定性，實(shi)驗(yan)(yan)結(jie)果(guo)在(zai)上(shang)述標準的(de)±20%以(yi)內都(dou)為可以(yi)接(jie)受的(de)范圍。如(ru)果(guo)結(jie)果(guo)在(zai)驗(yan)(yan)收標準20%以(yi)下的(de)（即捕獲效率低于40%）可判定實(shi)驗(yan)(yan)失敗，公司(si)將承(cheng)擔該樣(yang)本(ben)(ben)的(de)試劑耗材及服務費(fei)等全(quan)部費(fei)用(yong)。
2. 如果實驗過(guo)程中確(que)認試(shi)劑耗材質量(liang)的(de)問(wen)題(ti)，我公(gong)司負責向10x Genomics廠(chang)家(jia)申請(qing)賠付(fu)。（通過(guo)其它渠道采購的(de)試(shi)劑耗材，我們也將(jiang)協助客(ke)戶完成索賠）
3. 如果細(xi)胞樣品未達到(dao)要(yao)求，客戶(hu)可以選擇(ze)重新送(song)樣或風(feng)險上(shang)機(ji)，風(feng)險上(shang)機(ji)將不能(neng)按照上(shang)述標準(zhun)驗收。
七．常見問題解(jie)答
1. 10x Genomics廠家的捕獲成功標準(zhun)是65%，為什(shen)么貴(gui)公(gong)司承諾只有50%？
答：廠(chang)家測試捕(bu)獲效率(lv)用的是(shi)細(xi)(xi)胞(bao)系，細(xi)(xi)胞(bao)系樣(yang)品很容易制(zhi)備(bei)成單細(xi)(xi)胞(bao)懸液，且(qie)能保證較高的細(xi)(xi)胞(bao)活性(xing)和完整(zheng)性(xing)，而服務項目客戶很少用細(xi)(xi)胞(bao)系，大部分(fen)是(shi)用組織解(jie)離制(zhi)備(bei)的細(xi)(xi)胞(bao)懸液，其(qi)細(xi)(xi)胞(bao)成活率(lv)相對較低(di)，而且(qie)細(xi)(xi)胞(bao)計(ji)數的方法也(ye)會給結果造成一定(ding)偏(pian)差(cha)，因(yin)此我(wo)們把標準(zhun)定(ding)在50%。
2. 建好的(de)文庫送給測序公司上機前，文庫質檢(jian)達不到測序公司的(de)合格(ge)標(biao)準怎(zen)么辦(ban)？
答：測(ce)序(xu)(xu)公司出于免責的(de)考慮，對客戶自建的(de)文庫(ku)質檢(jian)標準(zhun)會比較嚴格(ge)，因此有可(ke)能我(wo)們(men)庫(ku)檢(jian)沒問題的(de)樣品測(ce)序(xu)(xu)公司會判定(ding)為不合格(ge)。請把測(ce)序(xu)(xu)公司的(de)文庫(ku)質檢(jian)結(jie)果發送劉(liu)元和牛松(song)，我(wo)們(men)根據質檢(jian)結(jie)果判定(ding)是否應承擔測(ce)序(xu)(xu)上(shang)機風(feng)險。
3. 如果實(shi)驗失敗了，貴公司如何賠償？
答：兩(liang)種情況，一是如(ru)果因10x芯片或試(shi)劑(ji)導致實(shi)驗失敗，我們負(fu)責(ze)聯系廠家索(suo)賠，服務(wu)項目就(jiu)更換試(shi)劑(ji)耗材重新做實(shi)驗。二是客戶細胞樣(yang)品合格、非風險上(shang)機情況下建庫失敗，就(jiu)不收取費用。實(shi)驗過程中的問(wen)題，我們和(he)客戶應本著(zhu)互信原則協(xie)商解決，實(shi)驗失敗我們不對客戶細胞樣(yang)品進(jin)行賠償。
4. 除了利(li)用10x Genomics的Cell Ranger進行(xing)的標準(zhun)分析外，貴公(gong)司(si)還能提供哪些分析？
答： 基本分析(xi)
⑴ 提取測序(xu)序(xu)列(lie) 將bcl文件(jian)轉化為fastq，生(sheng)成后期(qi)的樣本index序(xu)列(lie)文件(jian)，UMI序(xu)列(lie)及MRNA序(xu)列(lie)。
⑵ 序列比(bi)對(dui)注釋 將序列比(bi)對(dui)到相應的(de)參(can)考基因組的(de)基因區域。
⑶ 按照細胞和基因組信息(xi)統計(ji)UMI，barcode信息(xi)，計(ji)算細胞和基因表達矩陣(zhen)。
其他高級(ji)分析
⑴ t-SNE降維分(fen)析及聚類(lei)(lei)：利用(yong)T分(fen)布(bu)隨(sui)機相鄰嵌入法(t-SNE)對數(shu)據降維處理，基(ji)于(yu)2維數(shu)據展(zhan)示。利用(yong)聚類(lei)(lei)算法對細胞(bao)(bao)進行聚類(lei)(lei)分(fen)析，聚類(lei)(lei)后的細胞(bao)(bao)群體(ti)之間進行差異表達分(fen)析。
⑵ 基(ji)因的富集分析(xi)：差異基(ji)因進行后期的基(ji)因功(gong)能分析(xi)(GO和Pathway)。
